用液氮冷凍真空保存犢牛睪丸原質(zhì)細(xì)胞

犢牛睪丸細(xì)胞作為多種病毒增殖的基質(zhì)，已經(jīng)應(yīng)用在疫苗生產(chǎn)中，并有廣泛的開(kāi)發(fā)前景，但是由于產(chǎn)犢季節(jié)的不均衡，給生產(chǎn)帶來(lái)了困難，為了使生產(chǎn)不受季節(jié)影響，同時(shí)為了避免由保存原代細(xì)胞量大、細(xì)胞復(fù)活率低的問(wèn)題，做了用液氮冷凍保存犢牛睪丸原質(zhì)細(xì)胞的試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1犢牛睪丸 出生三天內(nèi)的，未食初乳的本地黑白花公奶牛。

1.2細(xì)胞冷凍液的配制

冷凍液Ⅰ號(hào)：按本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的方法配制，配方略。

冷凍液Ⅱ號(hào)：按常規(guī)方法配制，即含20%特牛血清，含5%～10%二甲基亞礬的營(yíng)養(yǎng)液。

1.3待凍存細(xì)胞的制備

1.3.1原質(zhì)細(xì)胞的制備：將犢牛睪丸細(xì)胞經(jīng)一定方法處理后，即在原質(zhì)細(xì)胞自己接加入細(xì)胞凍存液中待凍，一般一對(duì)牛犢睪丸制備的原質(zhì)細(xì)胞可分裝于3～5個(gè)安瓶中。

1.3.2原代細(xì)胞的制備：按常規(guī)方法消化犢牛睪丸，制得細(xì)胞懸液，放置37℃溫室培養(yǎng)，3～4天形成致密單層后，按常規(guī)法消化、洗滌、離心，收集細(xì)胞泥，分別加入適量的細(xì)胞冷凍液，待凍。

1.3.3次代細(xì)胞的制備：將原代細(xì)胞按常規(guī)方法消化、培養(yǎng)，得次代細(xì)胞單層，再按上述方法收集細(xì)胞泥，加入適量細(xì)胞冷凍液，待凍。

2 細(xì)胞的冷凍

將上述加入細(xì)胞冷凍液Ⅰ號(hào)或Ⅱ號(hào)液的原質(zhì)細(xì)胞、原代細(xì)胞、次原代細(xì)胞的細(xì)胞瓶，放置4℃、30分鐘，再移到-50℃～-70℃冰箱中預(yù)冷2小時(shí)，然后迅速移到液氮罐中。

3 細(xì)胞復(fù)蘇

將安瓶自液氮罐中取出，立即放入38-40℃溫水中，使細(xì)胞在1分鐘內(nèi)融化，無(wú)菌吸出細(xì)胞懸液，加入新的生長(zhǎng)液，將細(xì)胞稀釋成50萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml，37℃培養(yǎng)4小時(shí)，細(xì)胞貼壁后換液一次，繼續(xù)增減形成單層細(xì)胞。

4 結(jié)果與討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

備注：

1 每批凍存細(xì)胞凍前都有正常細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)照，以確定細(xì)胞消化成功與否。

2 凍存細(xì)胞復(fù)活率是指復(fù)蘇后細(xì)胞數(shù)/凍前活細(xì)胞數(shù)比值。

3 細(xì)胞生長(zhǎng)情況批復(fù)蘇后37℃培養(yǎng)4天時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)的致密情況。

4 復(fù)蘇后的細(xì)胞接毒培養(yǎng)后，均能有效帶毒，同正常培養(yǎng)細(xì)胞無(wú)差別。

從上表可以看出：

1 用凍存方法保存牛睪丸原質(zhì)細(xì)胞，方法是可行的，這給應(yīng)用牛睪丸細(xì)胞增值病毒的生產(chǎn)和試驗(yàn)帶來(lái)了極大的方便，有利于適當(dāng)安排生產(chǎn)，同時(shí)給器官細(xì)胞的保存提供了可靠的依據(jù)。

2 從上表可見(jiàn)應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室配制的細(xì)胞凍存液凍存的細(xì)胞，復(fù)蘇后的存活率要比正常的細(xì)胞凍存液要高。

3 從上表可以看出，原代、次代細(xì)胞經(jīng)凍存后，復(fù)蘇的存活率為零，具體原因有待于今后進(jìn)一步探討。