探索超低溫冷凍對綿羊卵母細胞四跨膜蛋白CD9的影響

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1.卵母細胞的采集和體外成熟培養(IVM)

從屠宰場收集的新鮮綿羊卵巢，放在滅菌過并預熱的37℃、0.9%生理鹽水保溫杯中，送到實驗室。再用同樣生理鹽水清洗卵巢2～3遍，直至干凈。使用抽吸法吸取卵泡液，顯微鏡下篩取顆粒細胞緊密的卵丘卵母細胞復合體(COCs)，放入預先加熱的采卵液和成熟液各洗3次，放入成熟微滴中，CO2培養箱中培養23～24h。培養時間結束后使用透明質酸酶去顆粒細胞進行10～15min的消化。在顯微鏡下挑選形態完整、胞質均勻并排出*極體的卵母細胞。

2.卵母細胞的冷凍保存

BS、VS、ES預先在室溫下平衡20min左右，再把處理好的細胞放入BS中稍微洗滌后就移入ES中停留5～10min，經過皺縮又復張到原先大小的80%為止，再移入VS后一并吸入冷凍管中，投入液氮罐中進行冷凍保存。

3.解凍

將1.0mol/L蔗糖溶液37℃預熱20min，再將1.0、0.5、0.25mol/L蔗糖溶液和BS分別放入預熱的4孔皿中，室溫下平衡20min。將冷凍細胞分別在上述梯度蔗糖溶液中分別放置3min，后轉入BS中，緩慢升溫5min，即可進行下一步試驗。

4.免疫組化

用預熱的生理鹽水清洗卵巢后放入4%多聚甲醛中，4℃固定24h，然后移入30%蔗糖溶液中脫水，脫水至卵巢在自然狀態下下沉至底部即可。將處理好的卵巢放入冷凍切片機里冷凍30min，用O.C.T.包埋。切片厚度為10μM的卵巢放在防脫載玻片上放進PBS溶液中4℃過夜。用0.1%TritonX-100里通透30min，用PBS在脫色搖床上搖洗3次，每次10min。然后放入CD9一抗Anti-CD9Antibody(1：100)(陰性對照加PBS代替一抗)中4℃過夜。經一抗孵育的切片用PBS搖洗3次，每次10min后室溫搖床孵育二抗GoAtAnti-rAbbitI9GH&L(1：200)孵育1～2h，再用PBS搖洗3次，每次10min。DAPI室溫孵育5min，PBS搖洗3次，后滴加抗熒光淬滅劑，即可熒光顯微鏡觀察。

5.實時熒光定量PCR

(1)綿羊卵母細胞總RNA的提取 RNA提取依據微量樣品總RNA提取試劑盒說明書進行。卵母細胞的收集同1.2.1、1.2.2和1.2.3步驟，各收集300個新鮮GV期、MⅡ期卵母細胞和冷凍GV期、MⅡ期卵母細胞，離心去上清加入350μL終濃度1%裂解液，再加5μL的4ng/μLCArrierNA工作液，勻漿，加入1倍體積70%乙醇，再將所有液體移入吸附柱crⅠ上放進離心管里，12000r/min離心1min，棄廢液。加350μL去蛋白液，12000r/min離心1min，棄廢液。管中加80μL配制好得dnAsEⅠ工作液，室溫放置15min加350μL去蛋白液，12000r/min離心1min，棄廢液。再加500μL漂洗液，室溫放置2min，12000r/min離心1min，棄廢液。12000r/min離心2min，棄廢液，置于室溫數分鐘以*曬干殘余漂洗液。將吸附柱crⅠ放入新的離心管中，加入14μLrNAse-freeddh20，室溫放置2min，13000r/min離心2min，所得溶液為RNA溶液。用酶標儀測定RNA的D260nm/D280nm值。

(2)總RNA反轉錄合成cDNA 按照Pri-mESCriptTMrTMAsterMix(PerfectreAl-time)試劑盒說明書，PCR反應總體系為20μL：5×Prime-ScriptTMrTMAsterMix4μL，rNA5.5μL，rNAse-freeddh2O10.5μL。輕輕混勻，37℃15min，85℃5s，溫度降到4℃終止反應，-80℃保存。

(3)實時熒光定量PCR 利用SYBr PreMixExTAqTMⅡ檢測綿羊卵母細胞CD9基因的相對表達量。引物序列見表1

PCR擴增體系20μL：SYBR(PreMixExTAqTMⅡ(2×)10μL，ROXReferenceDye(50×)0.4μL，上、下游引物(10μMoL/L)各0.5μL，RNAse-free ddH2O7.6μL，cdnA1μL。每個樣品做3個技術重復和3個平行試驗。PCR反應程序：95℃30s;95℃30s，61℃30s，72℃20s;95℃1Min，55℃30s;95℃30s。反應結束后根據所得ct值計算CD9mRNA的相對表達量，采用sAs軟件中GLM進行方差分析，并使用鄧肯氏多重比較，P<0.05為差異顯著。

6.Western blotting分析 卵母細胞的蛋白提取采用了細胞總蛋白提取的方法。同1、2和3步驟收集新鮮GV期、MⅡ期卵母細胞和冷凍GV期、MⅡ期卵母細胞各500個，10000R/Min離心2Min，棄上清液。震蕩至細胞沉淀*擴散。加28μLRiPA裂解液，用超聲波破碎儀破碎數秒后再加2μLPMSF蛋白酶抑制劑和2μLβ-巰基乙醇，整個過程均在冰上進行，后加8μLSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)充分混合后，95℃變性5Min。配制5%濃縮膠和12%分離膠，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。在20MA電流、20MV恒壓的條件下進行轉膜，取出PVdF膜后放入封閉液中，室溫搖床1～2h，以便去掉膜上的非特異性蛋白，提高目的蛋白與抗體的特異性結合。分別放入Anti-CD9Antibody(1：1000)和MsMAbtobEtAActin(1：2000)中，4℃過夜。取出與一抗孵育的膜，用洗膜液搖洗3次，每次10Min。再分別與CD9二抗donKEyAnti-RAbbitiGGh&L(hRP)(1：2000)和β-Actin二抗GoAtAnti-MousEiGG(h&L)hRPconJuGAtEd(1：2000)在室溫搖床孵育1～2h，洗滌3次，每次10Min，dAb染色，觀察結果。